韋塞爾斯布朗病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

產品及特點：

韋塞爾斯布朗病毒（Wesselsbron Virus、SV）引起韋塞爾斯布朗病（Wesselsbron disease、WSL），它是一種經蚊蟲傳播的蟲媒人畜共患傳染病毒，主要感染羊和其他一些反芻動物，可引起綿羊和山羊的流產及羔羊死亡，也會感染人。隨著我國與非洲國家交往的不斷加強，國際貿易范圍不斷擴大，韋塞爾斯布朗病傳入我國的風險不斷加大，我國已明確將其列八從非洲進口反芻動物議定書的檢疫要求中，掌握該病的流行狀況、開展相應的診斷檢測技術研究以及制訂相關技術標準不僅十分必要而且迫在眉睫。本產品就是為此目的根據 PCR原理開發的試劑盒。

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據韋塞爾斯布朗病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色蓋)
試劑三	熒光PCR專用模板稀釋液	1 mL(黃蓋)
試劑二	韋塞爾斯布朗病毒qPCR引物混合液	100μL(白蓋)
試劑四	韋塞爾斯布朗病毒qPCR探針	50μL(棕色管)
試劑五	韋塞爾斯布朗病毒探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL(紅蓋)
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	N+2個樣品管	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管(2-7管)
2×ProbeqPCRMagicMix	10μL	10μL	各10μL
韋塞爾斯布朗病毒qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
韋塞爾斯布朗病毒探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號)	--	--	各7μL(2號樣到2號管，3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR 反應40個循環	95℃	15 sec
PCR 反應40個循環	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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韋塞爾斯布朗病毒探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
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